Крио

Научные отчеты, том 12, Номер статьи: 9930 (2022) Цитировать эту статью

1352 Доступа

Подробности о метриках

Криогенная электронная микроскопия стала мощным инструментом изучения биологических объектов. Для небиологических объектов (растворов, гелей, дисперсий, глин) полемика по поводу интерпретации результатов криогенной микроскопии все еще продолжается, раскалываясь на две противоречивые тенденции: рассмотрение структуры как близкого к реальному состояния образца или как артефактов замерзания. В этом исследовании микроструктура ряда стабильных водных растворов и дисперсий (агар, каолин, монтмориллонит, наночастицы) была исследована с помощью крио-СЭМ и конфокальной ЛСМ с целью сравнения криофиксированных и незамороженных структур. Замеченная корреляция между этими двумя методами для изученных систем (агар, каолин, монтмориллонит, НЧ) позволила утверждать, что упорядоченная микроструктура является неотъемлемой чертой этих систем. Обсуждались некоторые несоответствия размеров микроструктуры, которые объяснялись различиями объемного и интерфейсного слоев. Предполагается, что растворы NaCl также обладают динамической (фемтосекундный уровень) микроструктурой кластеров чистой воды и сольватированных ионов Na+ и Cl-, что может влиять на аномальные свойства электролита.

С момента открытия криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ) более тридцати лет назад в этой области было накоплено много данных1,2. Этот метод визуализации позволяет наблюдать образцы в микро- и наномасштабах в их естественной водной среде без высыхания, вызывающего необратимую деформацию структуры. Наблюдение становится возможным благодаря затвердеванию воды криогенными агентами, т. е. криофиксации. Последнее является важным шагом в этом методе: сверхбыстрое замораживание предотвращает рост кристаллов льда, сохраняя исходные структуры нетронутыми. Криофиксация обычно достигается путем погружения образца в криоагент (азотную жижу, пропан, этан и т. д.), после чего следует разрушение (для наблюдения внутренней структуры образца) и сублимация (т. е. травление льдом), что позволяет наблюдать структуру без слоя воды. Сегодня крио-ЭМ техника стала мощным инструментом изучения биологических объектов. Длительная дискуссия о соответствии их микроструктуры в криофиксированном и незамороженном состояниях завершилась консенсусом в отношении того, что результаты криоЭМ отражают близкое к реальному состояние биологических образцов в части их более плотных структурных элементов (скелет, мембрана и т. д.). )1,2. Консенсус был основан на накопленных данных, показывающих корреляцию между различными методами визуализации. Что касается жидких и гелеобразных биологических компонентов (слизи, меж- и внеклеточной жидкости и др.), то остаются сомнения, которые могут быть связаны с трудностями визуализации структур малой плотности (малая контрастность, подвижность и др.). . Одним из путей решения этой проблемы является разработка методик, позволяющих наблюдать влажные образцы в условиях, близких к нативным, с высоким разрешением. В этом направлении сообщалось о разработке нового атмосферного SEM (ASEM), который представляет собой комбинацию инвертированного сканирующего электронного микроскопа (со съемной чашкой для открытой культуры) и флуоресцентного микроскопа3. ASEM позволяет квазиодновременно наблюдать одну и ту же область сверху и снизу образца в водном растворе (инкапсулированном в электронопроницаемую пленку SiN) при атмосферном давлении. С помощью этого метода были визуализированы нейронные связи, остеобласты, эндоплазматическая сеть, костные ткани, клеточный эндоцитоз и митоз3,4.

По сравнению с биологическими объектами небиологические водные системы (например, растворы, дисперсии, гели, глины) не обладают выраженными (плотными) фазовыми границами в воде, а интерпретация их крио-ЭМ результатов до сих пор неоднозначна и распадается на две противоречивые тенденции. Согласно одной из тенденций, микроструктура, наблюдаемая на криофиксированных образцах, интерпретируется как результат образования водных кристаллитов – как артефакт замерзания5,6,7,8,9,10,11. Последнее появляется, когда растворенные/диспергированные вещества диффундируют к периферии кристаллов льда, что приводит к образованию структуры7. В рамках другого направления микроструктура криофиксированных образцов рассматривается как состояние, близкое к реальному. Эта точка зрения часто подтверждается корреляцией с изображениями оптической или конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (LSM), как было показано, например, для вспененных жидкостей гидроразрыва, эмульсий, образованных яблочным пектином, дисперсий наночастиц, минеральных глин8,11,12, 13,14,15. Замеченные различия в размерах микроструктуры (при сравнении результатов LSM и крио-ЭМ) не были интерпретированы и, таким образом, ввели в заблуждение8. Противоречивые мнения о криофиксированной микроструктуре указывают на несоответствие экспериментальных результатов общепринятому представлению о растворах и коллоидах как о однородно распределенных молекулах/ионах/частицах в растворителе16. Таким образом, полемика по поводу интерпретации результатов криогенной микроскопии небиологических образцов все еще продолжается, и необходимы дальнейшие исследования для выяснения этой проблемы.