В

Nature Communications, том 14, номер статьи: 1545 (2023) Цитировать эту статью

1750 Доступов

21 Альтметрика

Подробности о метриках

Основная протеаза SARS-CoV-2 (Mpro) отвечает за расщепление вирусного полипротеина. Самопроцессинг Mpro называется созреванием, и он имеет решающее значение для димеризации и активности фермента. Здесь мы используем C145S Mpro для изучения структуры и динамики N-концевого расщепления в растворе. Анализ нативной масс-спектроскопии показывает, что смешанные олигомерные состояния состоят из расщепленных и нерасщепленных частиц, что указывает на то, что N-концевой процессинг не имеет решающего значения для димеризации. Крио-ЭМ структура размером 3,5 Å позволяет получить подробную информацию о N-концевом расщеплении Mpro вне ограничений кристаллического окружения. Мы показываем, что разные классы ингибиторов смещают баланс между олигомерными состояниями. В то время как нековалентный ингибитор MAT-POS-e194df51-1 предотвращает димеризацию, ковалентный ингибитор нирмарелвир индуцирует превращение мономеров в димеры, даже с интактными N-концами. Наши данные показывают, что димеризация Mpro запускается индуцированной подгонкой из-за ковалентной связи во время обработки субстрата, а не N-концевого процессинга.

Возбудителем COVID-191 является коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2). Подобно SARS-CoV и коронавирусу ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV), SARS-CoV-2 представляет собой вирус с одноцепочечной РНК (оцРНК), принадлежащий к роду бета-коронавирусов1,2. Геном SARS-CoV-2 состоит почти из 30 000 нуклеотидов и содержит ген ORF1ab, большую открытую рамку считывания (ORF), ответственную за кодирование 16 неструктурных белков (nsp) в виде двух полипротеинов после рибосомального сдвига рамки считывания, названных 1a и 1б1,2,3. Протеолитический процессинг вирусных полипротеинов необходим для жизненного цикла вируса и осуществляется двумя цистеиновыми протеазами, кодируемыми SARS-CoV-2: папаинподобной протеазой (PLpro), которая является одним из доменов nsp3, и основной вирусной протеазой. (Mpro или 3CLpro), кодируемый nsp54,5. PLpro расщепляет вирусный полипротеин в трех сайтах, тогда как Mpro отвечает за расщепление полипротеина в одиннадцати различных сайтах4,5, включая его собственные N- и C-концы6. Mpro — одна из наиболее многообещающих целей для разработки лекарств против SARS-CoV-25,7. Вся собранная структурная и биохимическая информация по этой цели имела решающее значение для быстрой разработки новых противовирусных препаратов8,9,10,11, включая недавний препарат Паксловид/нирмарелвир10, одобренный для экстренного применения в США, Европе и Китае.

Чтобы получить гетерологичный экспрессируемый зрелый Mpro, исследователи приняли общую стратегию добавления C-концевой части nsp4 к N-концевой части конструкций nsp5, что обеспечивает саморасщепление и димеризацию Mpro in-vitro6. Ранее мы описали активность и биохимический профиль мутанта Mpro C145S SARS-CoV-2, содержащего C-концевую часть nsp4 на его N-конце6. Эта мутация серина привела к появлению активной, но гораздо более медленной версии Mpro, ценного инструмента для изучения биохимических аспектов этого фермента. В отличие от димерного Mpro, этот образец вел себя как динамическая смесь мономеров, димеров, тримеров и тетрамеров в растворе6. Остаточная активность этого серинового мутанта позволила медленно расщеплять N-концевой пептид nsp4-nsp5, что позволило нам контролировать олигомерные состояния Mpro в растворе в процессе созревания6. Мы заметили, что тетрамерная форма Mpro C145S достигает равновесия в виде димеров в течение двух дней, что прямо пропорционально распаду N-конца, что позволяет сделать вывод, что N-концевой процессинг имеет решающее значение для димеризации6. Кроме того, ранее мы выявили кристаллическую структуру Mpro C145S в комплексе с С-концевым пептидом nsp5-nsp6, полученным из тетрамерного образца Mpro, представляя подробное описание этого ключевого события созревания расщепления. Таким образом, два зрелых димера Mpro собираются в временный комплекс димер-димер, позиционируя C-конец одной молекулы Mpro по направлению к активному сайту другой, с последующим C-концевым процессингом в ходе транс-расщепления6.